Innovación y tecnología para laboratorio
Cultivo de células madre messenquimales
Microportadores de fijación mejorada mediante un protocolo de agitación continúa
Los microportadores son pequeñas esferas que se utilizan para cultivar células adherentes a escalas que no son prácticas con los equipos de cultivo bidimensionales (2D) tradicionales. Los microportadores maximizan el área de superficie para el crecimiento de células adherentes y minimizan el volumen total del cultivo o el espacio. Los cultivos basados en microportadores, en los que las células se cultivan en microesferas suspendidas, se pueden mantener a pequeña escala en matraces giratorios (de 100 ml a 3 l) o a gran escala en biorreactores de tanque agitado (de 5 l a 10 000 l).
Aunque los métodos de cultivo 2D están bien establecidos para la mayoría de los tipos de células, se requiere el desarrollo y la optimización de protocolos para el cultivo celular basado en microportadores.
Por lo general, la optimización se logra a pequeña escala en matraces giratorios y utiliza mediciones fuera de línea para monitorear el crecimiento celular, los niveles de gas y el intercambio de nutrientes. Las condiciones de cultivo se optimizan para permitir una distribución uniforme de células en microportadores con un cizallamiento mínimo al tiempo que se permite un intercambio suficiente de nutrientes y gases.
Corning ha comercializado microportadores estériles, listos para usar, con diferentes químicas de superficie para diferentes tipos de células
Materiales y Métodos
Células: células madre messenquimales humanas derivadas de médula ósea.
Microportadores: Microportadores de fijación mejorados, recubiertos de colageno de Corning y matraz agitador de vidrio de 1L.
Recipientes: Matraz de cultivo célular de cuello con tapa de ventilación, recipiente para cultivo célular y placas multipozo transparentes de 6 pozos con superficie.
Medios y reactivos: Medio DMEM, suero fetal bovino MSC-qualifed, agua estéril apta para cultivo celular, DPBS, enzima TrypLE.
Consumibles: Filtro celular, frascos de poliestireno de fácil agarre, pipeta serológica y tubo de de centrifuga de PP de alta claridad.
Equipo de laboratorio: Agitador magnético Wheaton Micro-Stir y analizador Vi-CELL.
Ampliación de hMSC a partir de la decongelación
Las hMSC se descongelaron de un vial de almacenamiento criogénico y se sembraron a 5000 células/cm2 en matraces Corning® CellBIND® surface T-175 en FBS/DMEM calificado para hMSC al 10 %.
Las células se subcultivaron después de 5 días cuando alcanzaron un 75% de confluencia (~20 000 células/cm2) y se sembraron a 5000 células/cm2 en recipientes Corning CellBIND surface HYPERFlask®
Al alcanzar un 75% de confluencia, se recolectaron las células (paso 3) y se sembraron en microportadores (1600 cm2 por matraz de agitación de vidrio siliconizado de 1 L, 11 g/L) a 6000 células/cm2 en un volumen final de 400 mL.
Protocolo de expansión de hMSC para generar una cantidad suficiente de células para el inóculo de microportadores
Para el cultivo de microportadores a escala de litros, se requieren de 20 a 100 millones de células para la siembra celular. Debido a la producción limitada de hMSC en el aislamiento, se requiere un método eficiente y consistente para generar una gran cantidad de células para un inóculo de microportadores.
Este método se utilizó para generar el inóculo celular necesario para la optimización de las condiciones de cultivo de microportadores en matraces de vidrio de 1 L.
Validación del protocolo de agitación continua en múltiples donantes de hMSC
Las hMSC aisladas de diferentes donantes de médula ósea suelen tener diferentes tasas de recuperación y expansión después de la criopreservación. Para probar la solidez de nuestro protocolo, se descongelaron y expandieron hMSC de 3 donantes de médula ósea en microportadores de adhesión mejorada de Corning
Para cada donante de hMSC, se realizaron dos experimentos independientes desde la descongelación hasta la expansión del microportador. Se observaron altos rendimientos celulares (>40.000 células/cm2) para todos los donantes, lo que confirma la solidez de este protocolo. Como se anticipó con la variabilidad en hMSC de diferentes donantes, se observó una mayor tasa de expansión celular para el donante 4880 en comparación con los donantes 4853 y 4415.
Medio de cultivo para células madre messenquimales
DMEM Corning® 1L (medio de Eagle modificado por Dulbecco)
Extraído de:
